PCR тест

Максимилиан Райндл учи химия и биохимия в LMU в Мюнхен и е член на редакционния екип на от декември 2020 г. Той ще се запознае с медицинските, научните и здравните теми за вас, за да ги направи разбираеми и разбираеми.

Още публикации от Maximilian Reindl Цялото съдържание на се проверява от медицински журналисти.

PCR тестовете са станали незаменима част от съвременната медицина и молекулярната диагностика. Тъй като са толкова прецизни, те се считат за "златен стандарт". Те могат да се използват в широк спектър от приложения, от откриване на патогени до скрининг за наследствени заболявания - т.е. навсякъде, където е необходимо надеждно да се открият дори и най -малките следи от наследствен материал. Разберете тук защо PCR тестът е толкова прецизен, къде се използва и как работи подробно.

Какво е PCR тест?

PCR тестът е лабораторен метод от молекулярната биология и медицина. Тестът се използва за директно откриване и характеризиране на генетичен материал. Експертите смятат, че PCR методът е лесен за изпълнение, универсално приложим и здрав.

В лабораторията PCR тестът се състои от две стъпки. В първата стъпка съществуващият генетичен материал се възпроизвежда с помощта на полимеразна верижна реакция, или за кратко PCR. По този начин могат да се изследват и най -малките следи от ДНК. Това е и причината PCR тестовете да са толкова чувствителни.

Във втори етап генетичният материал се отделя, „сортира“ и по този начин се характеризира според неговите свойства. Така се определя фината структура на ДНК.

Има много възможни приложения: Лекарите използват PCR тест, за да изследват например намазки за коронавируси, кръводаряване за ХИВ или скрининг на новородени за възможни наследствени заболявания. Бактериалните инфекции - например с туберкулозен патоген - или паразитни инфекции (малария) също могат да бъдат изяснени с PCR.

Те също така помагат в съдебната медицина за осъждане на нарушителите въз основа на генетичния им отпечатък или се използват като тестове за бащинство.

Всички тези приложения са обобщени под термина молекулярна диагностика. По този начин PCR намира практическо приложение в изследванията, диагностиката и съдебната медицина далеч отвъд откриването на патогена Sars-CoV-2.

(Corona) PCR тест срещу бърз PCR тест

Обикновено оценката на PCR тест се извършва в специализирана лаборатория. Това означава, че пробният материал се изпраща и изследва там. Резултатът обикновено се получава няколко дни по -късно.

Различни стартиращи фирми (GNA Biosolutions, Spindiag) наскоро представиха нови видове мобилни тестови устройства. За това те също получиха специални одобрения от Федералния институт за лекарства и медицински изделия (BfArM). С помощта на тези мобилни устройства за PCR тест PCR тест би бил възможен и без специализирана лаборатория.

Този подход има голям потенциал, тъй като надежден резултат от теста може да бъде наличен в рамките на няколко часа директно на мястото, където е взета пробата (център за изпитване).

Степента, до която тези системи за бърз PCR тест ще преобладават на практика, все още не може да бъде оценена. Също така все още не е известно колко бързо тестовите центрове ще бъдат доставени с тези устройства навсякъде.

Следователно в обозримо бъдеще ще продължат да се извършват „редовни“ лабораторни PCR тестове, които причиняват известно забавяне между вземането на проби и резултата от теста.

Колко надежден е PCR тест?

PCR е доказан метод за откриване в молекулярната диагностика и медицината. Счита се за така наречения златен стандарт с много нисък процент грешки. Тестовете се характеризират особено с много висока чувствителност и специфичност.

Чувствителност означава надеждността, с която тестът открива генетичния материал, който трябва да бъде открит.

Специфичност означава сигурността, с която тестът определя, че въпросният генетичен материал не присъства в пробата.

Кога работят PCR тестовете в случай на Sars CoV-2 инфекция?

По правило PCR тестът открива коронарна инфекция два до три дни преди и до 20 дни след появата на симптомите. Дори при заразени хора, които остават напълно без симптоми, тестът работи в критичен период от време, когато могат да заразят други.

В отделни случаи доказването на това е възможно дори 60 дни след появата на симптомите на заболяването.

В първия ден след корона инфекция, PCR тестът също може да бъде отрицателен, въпреки че е налице инфекция. В такъв случай няма достатъчно вируси в гърлото по време на теста за намазка. Въпреки това, ако има основателно подозрение за инфекция, лекарите обикновено извършват друг PCR тест през следващите дни.

възможни източници на грешки

Процентът на грешки в процеса на копиране на ДНК е незначителен на практика. Въпреки че ДНК полимеразите никога не работят правилно, те едва ли играят роля в процеса на PCR тест.

На практика възможните източници на грешки се крият в процеса на вземане на проби: Ето защо е важно обучения медицински персонал да извърши цитонамазките. Пробите от слюнка и гаргара биха могли да намалят точността, тъй като тук се наблюдават ефектите на разреждане.

Как работи PCR тест?

PCR тест се провежда, например, от семейния лекар или в специални тестови центрове. Първо лекари или обучени здравни специалисти вземат проба. Обикновено за теста се взема тампон от горните дихателни пътища. Това обикновено е под формата на тампон от уста или нос и гърло.

Възможно е и гаргара с разтвор за изплакване. Кръвна проба е нетипична за откриване на корона - но широко разпространена, например, при скрининг на новородени.

Независимо от вида на взетата проба, генетичен материал се намира върху памучния тампон, в разтвора за изплакване или в капка кръв. Този пробен материал се изпраща в лаборатория, където се изолира и пречиства.

След това PCR тест се разделя на две стъпки:

• PCR: В тази стъпка количеството на оригиналния генетичен материал се умножава.
• Електрофореза: Във втория етап сегментите на генома се "сортират" според размера. По този начин пробата може да се характеризира - определя се фината структура на генетичния материал.

Стъпка 1: PCR - „Полимеразна верижна реакция“

"PCR" е първата от двете работни стъпки: Тук се умножава количеството на съществуващата изходна ДНК. Защото само когато генетичният материал е наличен в достатъчно количество, той може да бъде изследван. Най -вече това е човешка ДНК; съответно тестовете за коронавирус са вирусна РНК.

Съкращението PCR означава английския термин „полимеразна верижна реакция“.

Какво е необходимо за PCR?

Изходната ДНК се намира в реакционен съд със специални вещества. Съществуващият генетичен материал служи като шаблон, който се копира в присъствието на определени ензими (Taq полимераза) и определени основни градивни елементи на ДНК.

Процесът на копиране се извършва в няколко - повтарящи се - цикъла.

Конкретно се комбинират следните вещества:

• Начална ДНК: пробен материал, който да бъде репликиран.
• Основни градивни елементи на ДНК: Това са нуклеобазите аденин, тимин, цитозин и гуанин.
• ДНК полимераза: Ензим, който свързва отделни градивни елементи на ДНК, за да образува добре дефинирана верига от ДНК. Новополучената нишка е огледално (допълващо) изображение на оригиналния изходен материал.
• Буферен разтвор: Полимеразната верижна реакция протича във физиологичен буферен разтвор. Това осигурява условия, подобни на тези в човешките клетки. Този разтвор поддържа стабилно рН и съдържа също магнезиеви йони. Тези контролирани условия са необходими, за да се гарантира функционалността на ДНК полимеразата.
• Праймери: Те се състоят от 16 до 24 базови двойки и служат като начална позиция и стартов сигнал. Праймерите показват ДНК полимеразата, в която моментът (на изходната ДНК) започва процеса на копиране.

Как се прави PCR тест?

Тъй като всички вещества, необходими за PCR, вече са в реакционния съд, действителният процес на копиране на генетичния материал може да започне. Това се стартира, контролира и спира отново от температурата.

Следователно реакционният съд се нагрява или охлажда целево до различни температури. Това става със специално устройство - така наречения термичен цикъл. Цялостната реакция отнема около един до два часа.

Отделните стъпки на PCR цикъл са:

• Денатурация на двойните нишки на ДНК: Пробата се нагрява до около 90 градуса по Целзий. В резултат на това оригиналната двойна нишка на ДНК се разделя на две отделни (допълващи се) единични нишки.
• Закрепване на грунда: Температурата се понижава до малко под 60 градуса по Целзий. В резултат на това праймерите (предни праймери, обратни праймери) се прикрепят към определени позиции на съответните единични нишки на ДНК.
• Удължаване: Температурата се повишава до малко над 70 градуса по Целзий. ДНК полимеразата сега започва своята работа при този температурен оптимум. Той се прикрепя към позициите на праймера и разширява оригиналната единична верига на ДНК стъпка по стъпка, докато се получи точно (допълнително) копие (синтез на ДНК).

След завършен цикъл температурата се повишава отново до около 90 градуса по Целзий - цикълът започва отначало.

Използвайки PCR метода, ДНК последователностите могат да бъдат репликирани до около три двойки килобази (kbp). Това съответства на около 3 000 основни градивни елементи на ДНК, свързани, за да образуват „верига“. За сравнение: човешкият геном съхранява чертежите и информацията за работата на клетката в около три милиарда базови двойки - геномът на коронавирус, от друга страна, се състои от 30 000 базови двойки. PCR тест може да се използва само за възпроизвеждане и изследване на къси участъци от общата ДНК.

Праймерите са от решаващо значение

Изборът на праймери е от решаващо значение за PCR процеса. В диагностиката на Sars-CoV-2 например се използват няколко праймера (мултиплекс PCR).

Корона PCR тестовете търсят три различни гена на вируса: Общата специфичност нараства до почти 99,99%. Това означава, че при този висок процент на попадения има само един фалшиво положителен тест на 10 000 изследвания (ако пробата е взета правилно).

Колко копиран генетичен материал има сега?

Нека приемем, че след първия цикъл има две идентични двойни нишки на ДНК.

След всеки цикъл количеството (копиран) генетичен материал се удвоява. Така количеството ДНК нараства експоненциално.

С други думи: след втория цикъл има четири еднакви двойни нишки - след третия цикъл осем двойни нишки - след четвъртия цикъл 16 двойни нишки и след петия цикъл вече 32 двойни нишки.

Медицинските специалисти обикновено повтарят този процес около двадесет до тридесет пъти.

Метафорично казано, това означава: Дори и само една двойна ДНК верига да е била открита в пробата в началото, след двадесет цикъла вече ще има милион идентични копия в реакционния съд.

Какво означава стойността на Ct?

Броят на завършените цикли на PCR се дава под формата на така наречената стойност Ct. „Ct“ произлиза от английския термин „цикъл на праг“. Тази стойност на Ct позволява да се правят изявления за количеството на търсения генетичен материал.

При ниска стойност на Ct 20 има много изходен генетичен материал. Въпреки това, ако стойността на Ct е висока - около 30 цикъла - съответно има малко ДНК. Следователно цикълът на PCR трябва да се провежда по -често.

Стъпка 2: Електрофореза "Сортиране по размер"

И накрая, ако има достатъчно „обогатен“ генетичен материал, може да се извърши това, което е известно като електрофореза. Учените използват определено свойство на ДНК: нейния електрически заряд.

Отделните градивни елементи на ДНК са свързани помежду си чрез (отрицателно) заредена гръбнака на захар-фосфат. Колкото по -дълга е определена ДНК последователност, толкова по -висок е нейният електрически заряд.

Ако генетичният материал се постави в определена носителска среда (агароза) и се приложи електрическо напрежение, сегментите на ДНК започват да се движат поради своя заряд. Тъй като по -дълъг участък от ДНК пътува по -бързо от по -къс фрагмент, те се разделят според размера.

По този начин генетичният материал може да бъде изследван и характеризиран. На практика неизвестна проба с известна референция обикновено се прилага към "начална линия" и се сравнява една с друга след определен период от време.

Ако "скоростта на миграция" е еднаква за двете последователности, това означава: Откриването е много вероятно положително - гена, който търсите, се съдържа в пробата.

Специален случай на коронавирус: подготовка на пробата и RT-PCR

Откриването на патоген за коронавирус е специален случай. Sars-CoV-2 е един от така наречените РНК вируси. Това означава, че геномът на Sars-CoV-2 е под формата на РНК (рибонуклеинова киселина).

РНК се различава от ДНК само по няколко начина. Наред с други неща, той се предлага като единична верига и се основава на захарната рибоза вместо на 2 "дезоксирибоза. Нуклеобазата тимин също е заменена с урацил като четвърта основа.

Тази вирусна РНК трябва да бъде "транскрибирана" в ДНК преди редовен PCR тест. Този процес се нарича обратна транскрипция (RT) - оттук и терминът RT -PCR. В хода на този процес се получава единична сДНК верига („комплементарна ДНК“). В следваща стъпка, единичната сДНК верига се допълва от втора, огледално обърната ДНК верига.

В края на подготовката на пробата има ДНК двойна верига, която съответства на първоначалния план на вирусна РНК: Само тази двойна верига вече може да се използва като шаблон в PCR тест.

Колко време отнема да се получи резултатът?

След изпращане на пробата в лабораторията, обикновено ще получите резултат след един или два работни дни.В тестовите центрове, които често изследват пробите на място, това може да отнеме само няколко часа. Периодът от време зависи до голяма степен от съответния изпитателен център и неговата логистика.

Въпреки сложните работни процеси, съвременните лаборатории могат да извършват PCR тестове с висока производителност. Специални автоматизирани устройства помагат при внедряването.

PCR тестът все още се счита за сравнително "бавен", но още по -надежден метод за откриване.

Какво се случва, ако резултатът е положителен?

Ако пробата е взета правилно, положителен PCR тест означава, че тестваното лице е много вероятно да бъде заразено със Sars-CoV-2.

Ако е потвърдено, че сте заразени с коронавирус с помощта на PCR тест, здравният отдел ще получи съобщение от съответната лаборатория за положителния резултат от теста. В такъв случай здравният отдел ще разпореди изолация или карантина.

Автоматично ли съм заразен, ако получа положителен PCR тест?

През повечето време да. Но не винаги. Резултатът от PCR тест винаги трябва да се тълкува в контекста. Положителният тест преди всичко означава, че имате вирусен материал в себе си.

Ако едва наскоро сте страдали от Covid 19 (няколко дни), PCR тестът все още може да бъде положителен - въпреки че вече сте отново здрави. Това е специален случай и недостатък на силно чувствителния тест, тъй като той също може да открие фрагменти от вирус, които не могат да се възпроизведат.

Понякога е полезен допълнителен тест за антитела

В такива случаи тестът за антитела осигурява сигурност, която гарантира валидността на PCR теста. Най -добре е да обсъдите това с Вашия лекар. Те могат да ви помогнат да интерпретирате правилно резултата от PCR тест.

Какво да направите, ако резултатът е отрицателен

Отрицателният резултат от PCR теста означава с голяма вероятност да не сте се заразили с Covid-19, когато е взета пробата и следователно в момента не са заразни. Възможно е обаче да сте в начален стадий на инфекция.

Обикновено корона инфекциите могат да бъдат открити едва на втория или третия ден след заразяването. Така че резултатът не е безплатен билет. Затова трябва да продължите да спазвате правилата за дистанция и хигиена и да продължите да носите маска FFP2 - за себе си и за защита на другите.

PCR тест при деца

Педиатричен PCR тест не се различава от PCR тест за възрастни. И вземането на проби, и интерпретацията на резултатите се отнасят както за деца, така и за възрастни.

Какви са рисковете от PCR тест?

PCR тестът не представлява физически риск. Само вземането на проби от назофарингеален тампон се възприема като досадно или неприятно от някои хора.

Колко струва PCR тест?

Всички разходи, направени за PCR тест, ще бъдат покрити, ако лекуващите Ви лекари или здравният отдел одобрят такъв тест. Възстановяването на разходите обикновено се разглежда, ако вече имате свои симптоми или сте имали директен контакт със заразени хора.

Дори в случай на положителен бърз или самотест, имате право на безплатен PCR тест.

Моля, обърнете внимание: Ако сте се тествали у дома и сте получили положителен резултат, трябва незабавно да си уговорите среща с вашия семеен лекар по телефона. Вашият лекуващ лекар ще обсъди по телефона допълнителната процедура с вас.

Като алтернатива е най -добре да се обадите на 116 117, за да се регистрирате за PCR тест. До теста за потвърждение в идеалния случай трябва да останете у дома, за да защитите себе си и другите.

Тагове:  бременност спортен фитнес интервю